外源蛋白表達(dá)過程中谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)錄組及代謝物的多變元分析

孫楊，劉秀霞，董貴斌，楊艷坤，白仲虎*

1(江南大學(xué)，糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué)，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

摘 要以谷氨酸棒狀桿菌為研究對象，在發(fā)酵罐水平30%溶解氧條件下對野生菌及表達(dá)EGFP的工程菌進(jìn)行平行培養(yǎng)，對培養(yǎng)20 h的菌體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，并對不同時(shí)間點(diǎn)所取樣品進(jìn)行代謝物檢測。利用多變元分析方法分析轉(zhuǎn)錄組和代謝物數(shù)據(jù)，其中主要利用主成分分析法進(jìn)行關(guān)鍵因素分析，利用正交偏最小二乘法判別分析進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，繼而通過S-plot得到不同溶解氧下的生物標(biāo)記物(biomarkers)，最終找到了8個(gè)關(guān)鍵基因。代謝數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明ATP、谷氨酸、乙酸、胞內(nèi)谷氨酸、甲硫氨酸及乳酸是外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵代謝物；通過不同時(shí)間點(diǎn)代謝物含量變化分析發(fā)現(xiàn)外源蛋白表達(dá)的代謝變化類似于低氧環(huán)境下的代謝變化現(xiàn)象，即糖酵解增強(qiáng)，TCA溢流，回補(bǔ)途徑增加，乙酸、乳酸生成增加。通過對比外源蛋白表達(dá)工程菌與野生菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及代謝物含量數(shù)據(jù)，為今后在代謝工程中菌株改造、優(yōu)化代謝獲得高效表達(dá)外源蛋白的谷氨酸棒狀桿菌表達(dá)宿主奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：谷氨酸棒狀桿菌；多變元分析；正交偏最小二乘法判別分析)；關(guān)鍵基因；轉(zhuǎn)錄組測序

谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacteriumglutamicum,C.glutamicum)作為一種革蘭氏陽性菌，由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，例如與大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比具有胞外分泌表達(dá)外源蛋白、不產(chǎn)生內(nèi)毒素等優(yōu)點(diǎn)[1-2]，近些年被廣泛應(yīng)用于外源蛋白的表達(dá)。然而C.glutamicum表達(dá)系統(tǒng)存在轉(zhuǎn)化效率低、可用遺傳工具少、蛋白表達(dá)量低等問題，為解決這些問題，已開展了許多相關(guān)研究。如構(gòu)建和優(yōu)化適合表達(dá)外源蛋白的載體，包括啟動子、信號肽、目的基因、表達(dá)方式的篩選及優(yōu)化等[3-5]；研究宿主基因的功能分析和調(diào)控機(jī)制，找出影響外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵基因用于宿主細(xì)胞的改造等。

近年來隨著組學(xué)不斷發(fā)展，人們對于C.glutamicum的基因背景更加了解，C.glutamicum基因組大小為3.2 Mb，編碼24 000個(gè)基因[6]，其大部分基因也得到了注釋和分析，然而對于C.glutamicum外源蛋白表達(dá)中的相關(guān)基因，還沒有太多的研究，因此我們通過轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-sequencing, RNA-seq)的手段，分析發(fā)酵罐水平表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的C.glutamicum[7]。首先通過GO (Gene Ontology)、KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)途徑分析對比了野生菌和表達(dá)EGFP工程菌在轉(zhuǎn)錄組水平的差異，其次在能量水平和物質(zhì)水平對2種菌株的差異基因和代謝物進(jìn)行了分析。在分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)時(shí)，通常控制的篩選標(biāo)準(zhǔn)為差異基因大于兩倍，p≤0.05，然而此種設(shè)置將會遺漏一部分對于外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵基因，因此本文通過利用基于SIMCA的多變元分析(Multivariate Data Analysis, MVDA)方法(PCA，principal component analysis；OPLS-DA, rthogonal Partial Least Squares-Discriiminate Analysis)[8]，對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，最終獲得了外源蛋白表達(dá)過程中的較全面的關(guān)鍵基因。對這些關(guān)鍵基因的研究將有助于加深對外源蛋白表達(dá)過程的理解，為提高外源蛋白表達(dá)的代謝改造提供新途徑和新靶點(diǎn)。最后為了進(jìn)一步研究EGFP的表達(dá)對C.glutamicum胞內(nèi)關(guān)鍵代謝物的影響，本文通過相同的MVDA方法對不同時(shí)間點(diǎn)所取樣品的代謝物進(jìn)行分析研究。

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綜上，本文通過利用MVDA的方法(PCA, OPLS-DA)，對轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)整體進(jìn)行分析，更加全面地從統(tǒng)計(jì)學(xué)角度分析了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，為C.glutamicum的代謝改造提供了關(guān)鍵基因靶點(diǎn)。同樣地對代謝數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，找出了外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵代謝物質(zhì)，對外源蛋白表達(dá)相對于野生菌的代謝變化的理解提供了更進(jìn)一步的解釋說明和有利證據(jù)。

1.1材料

1.1.1 菌株

由實(shí)驗(yàn)室保存的張家港華昌制藥贈予的谷氨酸棒桿菌命名為CorynebacteriumglutamicumBZH001 (C.glutamicumBZH001)，表達(dá)EGFP的工程菌CorynebacteriumglutamicumpXMJ19-EGFP (C.glutamicumEGFP)為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存的菌種[9]。

1.1.2 試劑和儀器

RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及定量PCR試劑盒均購自TaKaRa公司；ATP檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測購于上海碧云天生物有限公司；乳酸、丙酮酸、甲醇以及常用氨基酸均為國產(chǎn)優(yōu)級純試劑。

主要儀器有：Applikon EZ-control 5 L發(fā)酵罐、安捷倫1200液相色譜儀、超純水系統(tǒng)、紫外分光光度計(jì)、化學(xué)發(fā)光儀、高通量破碎儀、高速冷凍離心機(jī)、熒光定量PCR儀等。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖25 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41 g/L，尿素2 g/L，玉米漿30 g/L，(NH4)2SO420 g/L，pH 6.8～7.0，1×105Pa，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖30 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO41 g/L，玉米漿15 g/L，(NH4)2SO420 g/L，消泡劑萬分之0.5，pH 6.8～7.0，1×105Pa，115 ℃滅菌20 min。

1.1.4 軟件

商業(yè)化的多變元分析軟件用于多變元分析(PCA，OPLS-DA) -- SIMCA version 14.0 (MKS UmetricsAB, Sweden)

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

從-80 ℃冰箱取保藏甘油管1只，以1%接種量轉(zhuǎn)接于種子培養(yǎng)基中，30 ℃、230 r/min培養(yǎng)12 h后，按10%接種量接于裝有200 mL二級種子培養(yǎng)基的1 000 mL帶擋板搖瓶中，30 ℃、230 r/min培養(yǎng)12 h。在5 L發(fā)酵罐中，控制發(fā)酵溫度為30 ℃，pH 6.8，通過攪拌轉(zhuǎn)速和氧氣偶聯(lián)控制溶氧在30%，重復(fù)發(fā)酵3個(gè)批次。自動通過添加17%磷酸、純氨水，維持發(fā)酵液pH在6.8左右。在發(fā)酵20～22 h時(shí)以4 ml/h的速度開始添加300 g/L葡萄糖作為補(bǔ)充碳源，以控制葡萄糖濃度大于5 g/L。20 h時(shí)取樣，液氮迅速冷凍處理后保存于-80 ℃，待轉(zhuǎn)錄組測序時(shí)使用。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 轉(zhuǎn)錄組分析

總RNA的提取和RNA-seq過程參照[10]，clean reads以FASTQ的格式提交到NCBI的Sequence Read Archive (SRA)，登記號為GSE77502/GSE87077。

1.2.2.2 菌體濃度、葡萄糖、總蛋白量的測定

菌體濃度采用吸光度法測定，葡萄糖含量的測定參照3,5-二硝基水楊酸法(DNS)，總蛋白含量測定采用Bradford方法。

1.2.2.3 氨基酸、有機(jī)酸含量測定

氨基酸含量通過OPA衍生化后經(jīng)高效液相色譜(HPLC)檢測[11]。有機(jī)酸含量測定參照劉志成等的測定方法[12]。色譜柱采用安捷倫Agilent 1260，Hypersil GOLD (C18) 250 mm×4 mm 5 um，檢測器為紫外檢測器；檢測波長215 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μL；流動相：0.01 mol/L KH2PO4(pH2.5)：甲醇=97∶3；V=0.6 mL/min。

1.2.2.4 NAD+/NADH、NADP+/NADPH及ATP含量的測定

能量和還原力含量的檢測方法參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.2.5 RT-PCR驗(yàn)證

總RNA的提取通過Trizol法進(jìn)行提取。通過takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)為cDNA，通過ABI stepone Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀和SYBR RT-PCR試劑盒進(jìn)行RT-PCR，根據(jù)NCBI上基因序列設(shè)計(jì)相關(guān)引物。

表1Real-timePCR所用引物

Table1ThespecialprimerusedbyReal-timePCR

2 結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

本文對工程菌C.glutamicumEGFP和野生菌C.glutamicumBZH001進(jìn)行了3批次平行發(fā)酵培養(yǎng)，為了減少其他脅迫帶來的影響，控制溶解氧水平為30%，并在16 h開始進(jìn)行葡萄糖補(bǔ)料，控制葡萄糖濃度不低于5 g/L，并維持其他培養(yǎng)條件保持一致。培養(yǎng)至20 h時(shí)野生菌和工程菌都進(jìn)入穩(wěn)定期初期，此時(shí)細(xì)胞比生長速率相同，選取此取樣點(diǎn)作為轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)取樣點(diǎn)，消除了野生菌和工程菌細(xì)胞由于處在不同生長時(shí)期而造成的差異，另外此時(shí)外源蛋白合成速率較大并且有一定的積累(相對熒光表達(dá)量36587 RLU/OD600nm)，更容易找出工程菌和野生菌之間的差別。利用Ilumina hiseq 2500進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。測序結(jié)果表明工程菌和野生菌3個(gè)重復(fù)批次之間的變異系數(shù)CV2.5%，通過原始數(shù)據(jù)質(zhì)控之后，clean data 與C.glutamicumATCC13032基因組(NC_003450.3)進(jìn)行對比，唯一比對到基因組的reads為大于1 600 000，占總reads數(shù)84%以上，之后通過NOIseq處理六組clean data，并控制差異表達(dá)基因篩選條件為log2 ratio 1以及FDR0.05。以C.glutamicumBZH001作為對照組，C.glutamicumBZH001作為實(shí)驗(yàn)組，有244個(gè)基因顯著下調(diào)，319個(gè)基因顯著上調(diào)。差異表達(dá)基因中有14個(gè)基因log2 ratio 4，其中4個(gè)基因?yàn)榧僭O(shè)蛋白(NCgl1413, NCgl2845, NCgl2837及NCgl0910)，5個(gè)基因沒有相關(guān)注釋，其余5個(gè)基因(NCgl0055，NCgl0487，NCgl0833，NCgl0909及NCgl0303)的功能涉及轉(zhuǎn)錄、翻譯、轉(zhuǎn)運(yùn)等生命活動。其中NCgl0055與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)；NCgl0487(編碼與翻譯的延伸功能有關(guān)的50S核糖體蛋白L3 (rplC))出現(xiàn)約95倍的下調(diào)，而NCgl0833(編碼50S核糖體蛋白L33 (rpmG))出現(xiàn)24.18倍下調(diào)，有一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域。這兩個(gè)核糖體蛋白基因表達(dá)的下調(diào)可能跟EGFP表達(dá)的特殊性有關(guān)，但具體的原因還需進(jìn)一步研究。NCgl0909(編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體ATP酶)出現(xiàn)顯著性的上調(diào)，這意味著ATP結(jié)合性盒式轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白系統(tǒng)對糖類和氨基酸等底物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)活動的增加，為EGFP的表達(dá)提供足夠的底物。NCgl0303編碼的CspA家族的冷激蛋白與CspB同屬細(xì)胞膜蛋白類，有報(bào)道CspB蛋白突變體能促進(jìn)Fab抗體的分泌[14]。

差異表達(dá)基因進(jìn)一步通過KEGG數(shù)據(jù)庫(http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)和David數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp)進(jìn)行pathway和GO功能分析，發(fā)現(xiàn)差異基因富集最多的pathway為不同環(huán)境微生物代謝途徑，有46個(gè)差異基因的富集。而與代謝相關(guān)的糖酵解/糖異生、碳代謝、磷酸戊糖途徑和丙酮酸代謝也有相關(guān)的富集。另外有5個(gè)差異基因富集到磷酸轉(zhuǎn)移酶(phosphotransferase system, PTS)系統(tǒng)。PTS系統(tǒng)與糖的胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，通過磷酸化轉(zhuǎn)運(yùn)葡萄糖到胞內(nèi)進(jìn)行物質(zhì)代謝，從而為外源蛋白的合成提供能量和底物。而GO功能分析結(jié)果可以看出，控制p≤0.05，差異基因主要富集在生物過程(4)和分子功能(2)，差異基因富集在生物過程中的有：GO:0009401-磷酸烯醇式丙酮酸-糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、GO:0006355-轉(zhuǎn)錄和DNA模板調(diào)控、GO:0006096-glycolytic process和GO:0006351-轉(zhuǎn)錄和DNA模板。富集在分子功能中的有：GO:0008199-三價(jià)鐵耦合和GO:0035731-亞硝酸?；F復(fù)合物耦合。由KEGG和GO分析可以看出差異基因主要集中在中心代謝途徑，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)過程和翻譯過程。由此可見在外源蛋白表達(dá)過程中細(xì)胞內(nèi)代謝也發(fā)生了顯著性變化，通過對這些變化的研究，可以了解外源蛋白表達(dá)的特殊性和差異性。

2.2外源蛋白表達(dá)過程谷氨酸棒狀桿菌轉(zhuǎn)錄水平多變元分析

在對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，我們選擇了數(shù)據(jù)過濾閾值，即FDR0.05且foldchange2，這樣可以得到可靠的相關(guān)差異基因。但是與此同時(shí)也會丟失一些數(shù)據(jù)，即外源蛋白表達(dá)過程對C.glutamicum轉(zhuǎn)錄水平影響的相關(guān)基因。所以我們通過對控制溶解氧水平為30%條件下外源蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和相同條件下野生菌的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)即標(biāo)準(zhǔn)化的RPKM值進(jìn)行多變元分析，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法(PCA，OPLS-DA)，找出C.glutamicumEGFP與C.glutamicumBZH001轉(zhuǎn)錄水平的差異的關(guān)鍵基因。

對于任何數(shù)據(jù)組進(jìn)行多變元分析時(shí)，先從整體上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析非常重要，特別是對于分組的數(shù)據(jù)，整體分析可以看出組內(nèi)重復(fù)性的好壞和組間差異變量，并通過模型的好壞，確定模型的預(yù)測性和擬合度，因此我們通過PCA對外源蛋白表達(dá)工程菌和野生菌的六組數(shù)據(jù)及2566個(gè)基因進(jìn)行主成份分析。PCA是通過降維的方法對多變量參數(shù)進(jìn)行降維分析，從而用具有代表性的新變量來解釋說明整體變量參數(shù)，并對樣本進(jìn)行分類。由模型擬合結(jié)果可知，模型被擬合為3個(gè)主成分，模型擬合參數(shù)：R2X(cum)=0.874，說明模型能夠解釋說明87.4%的數(shù)據(jù)變化；Q2(cum)=0.429，說明模型能夠預(yù)測42.9%的變量，這兩個(gè)數(shù)據(jù)說明本次擬合度較好，建立模型的解釋能力和預(yù)測能力都較好。由loading plot (圖1A)可見工程菌和野生菌具有較好的聚類趨勢，都位于95%置信區(qū)間的Hotelling’s T2橢圓形內(nèi)，并在t[1]方向上有較好的分離度；野生菌和工程菌在t[2]方向上都有一定的趨勢，而這個(gè)趨勢的存在肯定由某些原因(樣本的處理，數(shù)據(jù)的處理等)造成的，因此通過對這個(gè)趨勢的分析，會在以后的試驗(yàn)中改進(jìn)模型的建立。由Score plot (圖1B)可知，樣本變量在t[1]兩側(cè)，分布密度較大，中間較小，因?yàn)樽兞繑?shù)據(jù)較大，無法單獨(dú)分析邊界變量，所以需要進(jìn)一步對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

A:Loading plot;G: C. glutamicum EGFP樣本組;W：C. glutamicum BZH001樣本組; B: Score plot

圖1 野生菌和工程菌的主成分分析

Fig. 1 PCA analysis result of C. glutamicum EGFP and C. glutamicum BZH001

為了進(jìn)一步得到工程菌表達(dá)過程中相對于野生菌的“biomarker”，我們首先對樣本進(jìn)行分組，分為工程菌(K-30，G-30，I-30)及野生菌(A-30，B-30，C-30)，再進(jìn)行OPLS-DA分析，并用S-plot進(jìn)一步分析。通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行Par scaling，S-plot類似于S型，而S-plot 圖中X 軸P[1]代表變量對于分組的影響程度，數(shù)值越大代表影響程度越大的變量。P(corr)[1]表示變量對兩組樣本區(qū)分的可信度，范圍為-1-1，越接近1表示可信度越大，因此通常在S-plot兩端的變量為區(qū)分兩組樣本的“Biomaker”[15]。S-plot作為OPLS-DA中的常用分析方法，被用于代謝物的“biomarker”分析。S曲線的左右兩側(cè)紅色的數(shù)據(jù)點(diǎn)即為最有可能造成模型差異的差異基因(圖2)。進(jìn)一步通過VIP圖可以得到這些基因?qū)δＰ拓暙I(xiàn)的差別。由圖2我們選擇了57個(gè)貢獻(xiàn)度最大的基因，這些基因涉及最多的為核糖體蛋白(rpsO、rpsR、rplC、rplJ)、應(yīng)激蛋白、分子伴侶(冷激蛋白，dnaK)及轉(zhuǎn)錄因子等。

圖2 OPLS-DA分析(S-plot)

Fig. 2 Analysis result of OPLS-DA S-plot

通過結(jié)合在30% DO下的差異基因和多變元分析出的共同基因，我們得到了8個(gè)基因(圖3A)，其中6個(gè)為核糖體蛋白，相關(guān)基因?yàn)镹Cgl0487 (50S 核糖體蛋白 L3)、NCgl0833 (50S 核糖體蛋白 L33)、NCgl0519 (50S 核糖體蛋白 L30)、NCgl2279 (50S 核糖體蛋白 L27)、NCgl0489 (50S 核糖體蛋白 L23)和NCgl0496 (30S 核糖體蛋白 S17)，參與到與23SrRNA的結(jié)合、肽基轉(zhuǎn)移酶的活性、確保翻譯的保真度等生命活動中[16]。另外兩個(gè)基因，NCgl0303編碼冷激蛋白，屬于CspA家族，同時(shí)也參與轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)過程，在工程菌中的表達(dá)量大于野生菌；NCgl2632編碼的蛋白雖然為假設(shè)蛋白，但進(jìn)行氨基酸序列同源對比發(fā)現(xiàn)，該蛋白與乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶相似。乙酰輔酶A在代謝中具有重要作用，是從糖酵解進(jìn)入TCA循環(huán)的關(guān)鍵物質(zhì)，另外在脂肪酸的β氧化中硫解反應(yīng)也產(chǎn)生乙酰輔酶A，而乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶在分解代謝中起到關(guān)鍵作用[17]，因此NCgl2632可能與蛋白的乙?；蚰芰看x有一定的相關(guān)性。選取4個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果表明這些基因與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相似，并且都具有較大的差異倍數(shù)(表2)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些基因在外源蛋白表達(dá)過程中的作用，需要進(jìn)一步研究這些基因的相關(guān)功能。

2.3代謝物多變元分析

為分析外源蛋白表達(dá)引起的代謝物含量變化，我們在發(fā)酵過程中每4個(gè)小時(shí)取一次樣，測定細(xì)胞內(nèi)外代謝物含量。從代謝隨時(shí)間變化的趨勢無法對代謝物變化進(jìn)行整體分析以及代謝物間的相互關(guān)系，因此對代謝物也采用多變元分析方法尋找影響本文EGFP表達(dá)的關(guān)鍵代謝物。分析對象為C.glutamicumBZH001和C.glutamicumEGFP在發(fā)酵罐培養(yǎng)水平8 h、20 h、36 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，進(jìn)行PCA分析(模型擬合為5個(gè)主成分，R2(cum)=0.932，Q2(cum)=0.631)。由圖4可見，同一樣本組沿平行方向被聚類在一起，并且同一取樣時(shí)間點(diǎn)的三個(gè)樣品被聚類在一起，表明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好。沿區(qū)分三個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣本方向的乙酸、PC、ATP三因素為區(qū)分不同時(shí)間點(diǎn)的關(guān)鍵變量。

A: C. glutamicum EGFP和C. glutamicum BZH001關(guān)鍵基因熱圖分析；B: 多變元分析得到的關(guān)鍵基因和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)維恩圖分析

圖3 外源蛋白表達(dá)關(guān)鍵基因分析

Fig. 3 Key gene analysis of foreign protein expression

表2差異基因的RT-PCR驗(yàn)證

Table2RT-PCRofDEGs

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)樣品代謝物的PCA分析

Fig. 4 PCA analysis result of metabolics of samplings

為找出對EGFP的表達(dá)貢獻(xiàn)度最大的代謝物，本文進(jìn)一步對樣本進(jìn)行OPLS-DA分析。圖5B為VIP圖，是對S-plot (圖5A)影響變量的排序。由圖5B可見，ATP、谷氨酸、乙酸、胞內(nèi)谷氨酸(Glu-in)、甲硫氨酸及乳酸為區(qū)分C.glutamicumEGFP與C.glutamicumBZH001的biomarker。對C.glutamicumEGFP與C.glutamicumBZH001中代謝物含量分析發(fā)現(xiàn)工程菌和野生菌中有較大差異倍數(shù)，利用T檢驗(yàn)分析P-value顯示兩組間有顯著性的差異(表3)，進(jìn)一步驗(yàn)證了這六個(gè)代謝物在工程菌和野生菌中的差異性，已知外源蛋白在合成過程中，氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)、肽鏈的折疊、蛋白的跨膜運(yùn)輸都需要ATP的參與。而C.glutamicum胞內(nèi)氨基酸生成中Glu含量最多，因而其對OPLS-DA分析的權(quán)重就越大。而乙酸和乳酸作為代謝分析的關(guān)鍵物質(zhì)，外源蛋白表達(dá)過程中工程菌中含量大于野生菌，這與在分析外源蛋白表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn)的外源蛋白表達(dá)具有類似于低氧環(huán)境下的代謝變化現(xiàn)象是一致的，如圖6所示，C.glutamicumEGFP相對于C.glutamicumBZH001葡萄糖消耗增加，糖酵解增強(qiáng)，異檸檬酸裂解酶活性增強(qiáng)，乙醛酸循環(huán)增強(qiáng)，亮氨酸和纈氨酸含量增加，谷氨酸和甲硫氨酸合成增加，TCA溢流，PEPK活性增加，回補(bǔ)途徑增加，乙酸、乳酸生成增加。TCA還原臂通量減少，而乙酸的生成量增加，促進(jìn)NADH生成的同時(shí)也保證了胞內(nèi)氧化還原水平的平衡。這些代謝物作為影響外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素，其合成的變化也影響了碳源的利用和能量的分配。以上結(jié)論有助于指導(dǎo)通過分子生物學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)對宿主進(jìn)行改造，提高能量和底物在蛋白合成途徑中的利用。

表3C.glutamicumEGFP與C.glutamicumBZH001關(guān)鍵代謝物含量分析

Table3CriticalmetaboliteconcentrationanalysisofC.glutamicumEGFPandC.glutamicumBZH001

3 結(jié)論與討論

C.glutamicum作為一種新的蛋白表達(dá)宿主具有許多優(yōu)點(diǎn)，目前被不斷地應(yīng)用在單鏈抗體、工業(yè)酶等方面。為了優(yōu)化外源蛋白的表達(dá)， 其表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建、表達(dá)元件的優(yōu)化和篩選也是目前研究的熱點(diǎn)。我們通過二代測序?qū)υ诎l(fā)酵罐水平培養(yǎng)的EGFP表達(dá)工程菌和野生菌進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序， 通過P-value和差異倍數(shù)進(jìn)行差異基因的篩選。但這種分析方法可能會丟失一些相關(guān)基因，因此我們首次通過多變元分析方法對EGFP在C.glutamicum中的轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)量(RPKM)進(jìn)行相關(guān)性分析，通過OPLS-DA找出與外源蛋白表達(dá)具有相關(guān)性的57個(gè)基因，并通過跟差異基因的對比，鑒定8個(gè)關(guān)鍵基因，為外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵途徑的探索和改造提供了新的研究靶點(diǎn)。此外我們又通過對不同時(shí)間點(diǎn)兩種菌株胞內(nèi)外代謝物進(jìn)行同樣的多變元分析，找出了ATP、谷氨酸、乙酸、Glu-in、甲硫氨酸、乳酸等與外源蛋白表達(dá)相關(guān)的代謝物，這與之前所發(fā)現(xiàn)的外源蛋白表達(dá)出現(xiàn)的類似低溶解氧條件下代謝現(xiàn)象相似(糖酵解增強(qiáng)，TCA shunt，回補(bǔ)途徑增加，乙酸、乳酸生成增加)，進(jìn)一步加深了對外源蛋白表達(dá)過程的了解。

A:S-plot; B:VIP圖

圖5 工程菌和野生菌不同時(shí)間點(diǎn)代謝物OPLS-DA多變元分析

Fig. 5 OPLS-DA analysis of metabolics of C. glutamicum EGFP and C. glutamicum BZH001

圖6 C. glutamicum EGFP 與C. glutamicum BZH001代謝變化

Fig. 6 Metabolism change between C. glutamicum EGFP and C. glutamicum BZH001.

注：六邊形代表酶活，方框表示代謝物，箭頭表示上調(diào)和下調(diào)。G-6-P：6-磷酸-果糖；3-PG：3-磷酸甘油醛；PEP：磷酸烯醇式丙酮酸；PYR：丙酮酸；LDH：乳酸脫氫酶；Lac：乳酸；PDH：丙酮酸脫氫酶；AcCoA：乙酰輔酶A；PC：丙酮酸羧化酶；PEPCK：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶；OAA：草酰乙酸；CIT：檸檬酸；ICIT：異檸檬酸；ICL：異檸檬酸裂解酶；α-KG：α-酮戊二酸；GDH：谷氨酸脫氫酶；Glu：谷氨酸；Suc：琥珀酸；MAL：蘋果酸；ICL：異檸檬酸裂解酶；MS：蘋果酸合酶。

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MVDAanalysisofRNA- seqandmetabolismdataduringtheprocessofrecombinantproteinexpressioninCorynebacteriumglutamicum

SUN Yang, LIU Xiu-xia, DONG Gui-bin, YANG Yan-kun, BAI Zhong-hu*

1(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 3(The Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

ABSTRACTThe engineering strain expressing EGFP (C.glutamicumEGFP) and wild type strain (C.glutamicumBZH001) were cultivated in parallel in 5 L fermenters under 30% dissolved oxygen concentration.Samplings at 20 h were analyzed through RNA-sequencing (RNA-seq).Extracellular and intracellular metabolites and key enzymes’ activity of both strains were investigated.Multivariate data analysis (MVDA) was used to deal with the RPKM data of RNA-seq and metabolism data.The principal component analysis (PCA) was used to analyze the principal component.And the S-plot of OPLS-DA was used to find the biomarkers ofC.glutamicumBZH001 andC.glutamicumEGFP.Eight critical genes were found,and ATP,glutamic acid,acetate,intracellular glutamic acid,methionine and lactate were identified as the critical metabolites.The metabolism-like anaerobic conditions were as followed: the glycolysis was enhanced,the TCA cycle was shunted,and the contents of acetate and lactate increased.This research laid a foundation for optimizingC.glutamicumhost structure to get high protein expression level.

Key wordsCorynebacteriumglutamicum; multivariate data analysis (MVDA); orthogonal partial least squares-discriiminate Analysis (OPLS-DA); critical genes; RNA-sequencing (RNA-seq)

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.014085

第一作者：博士研究生(白仲虎教授為通訊作者，E-mail：baizhonghu@jiangnan.edu.cn)。

基金項(xiàng)目：國家973 計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2013CB733602)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. 31570034)；江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No. BK20150148)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(No. JUSRP51401A)

收稿日期：2017-02-17, 改回日期：2017-03-09